Producción recombinante de la proteína Cas9 a partir de la expresión del plásmido pMJ922
Date
2023-11-01
Authors
Meneses, Carlos E.
Restrepo, Santiago
Obando, Erika
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Universidad CES
Abstract
La herramienta de edición genética CRISPR-Cas9, compuesta por una
endonucleasa Cas9 y un RNA guía, ha revolucionado notablemente la biología
molecular; sin embargo, encontrar la mejor alternativa para entregar sus
componentes continúa siendo un reto en lo que respecta a temas como la
capacidad de expresión o incluso de toxicidad. E. coli, cuyas ventajas lo convierten
en un organismo de elección frecuente en la producción de proteínas
recombinantes, constituye una alternativa para la obtención de la endonucleasa
Cas9 necesaria durante la formación de ribonucleoproteínas. El objetivo de esta
investigación consistió en establecer una metodología de producción de la
proteína Cas9 en E. coli, a partir de la expresión del plásmido comercial Pmj922.
Para llevar a cabo esta producción, el plásmido Pmj922, adquirido de forma
comercial, fue extraído mediante soluciones miniprep a partir de células DH5α
transformadas; posteriormente se confirmó la identidad del material genético
mediante un perfil de digestión con las enzimas de restricción EcoRI y XbaI. La
expresión de la proteína heteróloga se realizó en células BL21 termocompetentes
transformadas que luego fueron cultivadas hasta una OD600 de 0.6, y se añadieron como inductores el IPTG e IPTG + Arabinosa. Finalmente, se hizo
análisis de la expresión proteica por SDS-PAGE por medio de un gel de
poliacrilamida al 7.5%. Los resultados muestran que se obtuvo una mayor
expresión de la proteína Cas9 a una temperatura de 37°C en la prueba con los
dos inductores, arrojando una banda diferencial en el gel de poliacrilamida.
Description
Keywords
CRISPR-CAS9, E. coli, Proteínas heterólogas, Arabinosa, SDS Page