Abstract

Este estudio pretende evaluar el efecto de la atresia folicular temprana sobre la tasa de blastocistos producidos in vitro y la expresión de los genes OCT-4 y MATER en el oocito y de FST en células del cúmulo. Los ovarios son aspirados a las 0 h y a las 4 h después del faenado, las células del cúmulo son separadas en medio TL-Hepes con 2.5% de tripsina precalentada a 39 ° C y 5 min de vortex. Se ha determinado que un total de 80 oocitos son suficientes para obtener una adecuada cantidad de RNA (1.000- 3.000 ng/μl) extraído por el método Trizol®. El RNA total es pasado a cDNA y la estandarización de la qPCR se realizó con las siguientes secuencias de primers: OCT-4 (NM_174580.2) F 5´AGTGAGAGGCAACCTGAAGA3´ R 5´ ACACTCGGACCA CGTCTTTC3´, MATER (NM_001007814.2) F 5´GAAGTGTGGCTGCAGTTGA A3´ y R 5´ATGCCTCAGCAAATTCATCC 3´, FST (NM_175801.2) F 5´AAAACCTACCGCAACGAATG3´ y R 5´GAGCTGCCTGGACAGAAAAC3´, gen normalizador GAPDH F 5´TGCTGGTGCTGAGTATGTGGT3´ y R 5´AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT3´. La cuantificación se está realizando con el kit QuantiTect® SYBR® Green PCR y las condiciones de la qPCR son 95 ° C 15 min para una desnaturalización inicial y 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 60 °C por 20 s, 72° C por 20 s y una extensión final de 72 ° C por 5 min. Se realizarán tres repeticiones por cada grupo para analizar la expresión génica y las tasas de desarrollo embrionario. Los resultados se analizarán por ANOVA utilizando SAS 9.1.3 y la expresión génica relativa se calculará usando el software REST.