Resumen

Leptospirosis es una antropozoonosis reemergente y potencialmente mortal para el humano, y puede causar en algunos casos insuficiencia renal aguda, lesión hepática o síndrome de hemorragia pulmonar. La enfermedad es causada por espiroquetas gram negativas pertenecientes al género Leptospira, grupo de amplia diversidad genética que circula en la geografía colombiana, pero del que poco se conoce sobre estructura de su genoma, blancos genómicos de diversidad filogenética y factores de virulencia de Leptospira spp. La especie colombiana Leptospira santarosai serogrupo Automalis serovar Alice-Cepa JET (GenBank assembly accession GCA_000306475.2) fue aislada de un paciente con síndrome febril indiferenciado procedente de una de las regiones que reporta más casos al año, el Urabá antioqueño. Posterior a su determinación taxonómica, se ha estudiado en algunos aspectos biológicos y genómicos, no obstante, es necesario conocer más sobre su composición genómica y los mecanismos de su patogenómica. Para responder a esta necesidad, se propuso el presente estudio buscando que el conocimiento generado tuviera aplicación en la genómica funcional, filogenética e inferencia de factores de virulencia de la cepa colombiana haciendo uso de la disciplina emergente de patogenómica microbiana. La información completa para análisis fue obtenida de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ desde donde se accedió a las secuencias de genomas completos de 67 especies del género Leptospira spp basados en una descripción de sus similitudes y particularidades frente a otras serovariedades tanto del género como de la especie L. santarosai, la propuesta de un nuevo blanco de análisis filogenético alternativo al clásico gen 16s y la inferencia del comportamiento de factores de virulencia evaluados en un modelo experimental. El genoma de la cepa colombiana consta de un cromosoma mayor (Cromosoma I) y el cromosoma menor (Cromosoma II), los cuales suman un total de 4.13 Mb. Los cromosomas tienen un porcentaje de G+C de 41,6% tres genes para ARN ribosómicos distribuidos 1 para la subunidad 23s, 1 para la subunidad 16s y 1 para subunidad 5s, 6 de otros tipos de ARN y 37 genes de ARN de transferencia. Se infirieron dos pseudomoléculas cromosómicas para la cepa colombiana, asignando 3.796 y 318 proteínas a los cromosomas I y II respectivamente. El análisis de identidad genómica dio como resultado una identidad nucleotídica del 92,95% y un alto grado de sintenidad entre los cromosomas. Se identificaron 53 y 68 proteínas exclusivas para el serovar Shermani y la cepa colombiana respectivamente. De las 68 proteínas, en su mayoría son hipotéticas, no obstante, se identificaron nueve transposasas, dos integrasas y una proteína de membrana. La cepa colombiana comparte proteínas ortólogas con miembros de los diferentes subgrupos de 6 especies que oscilan entre 3.286-2.600 con las especies patógenas, 2.416-2.296 especies intermedias y 1.972-1.864 especies saprófitas y el 40,98% de las proteínas presentes en el genoma de la cepa colombiana tienen un alto porcentaje de identidad con las proteínas de la principal especie patógena L. interrogans (80-100% de similitud), lo que demuestra una fuerte relación genética entre la cepa colombiana y el subgrupo patógeno. Para la cepa, se encontró que contenía repeticiones CRISPR / Cas y se localizaron 9 familias de clase 1, tipo I y al subtipo I-A y I-E donde cada uno de estos subtipos contenían 8 genes cas; además, se encontraron 25 proteínas involucradas en la biosíntesis de novo de la vitamina B12. En la cepa colombiana se encontraron tres especies de estructuras de fagos diferentes que podrían facilitar la infección y posterior colonización en el hospedero. Actualmente, el análisis filogenético del género Leptospira se hace con el gen 16s ribosomal el cual contiene cerca de un 45% de polimorfismos, pero esta región no permite diferenciar entre las especies L. biflexa/L. wolbachii y L. meyeri/L. yanagawae. A partir del estudio genómico comparativo de la cepa colombiana frente al resto de especies del género, se propuso usar el gen rpoC (ADN dirigido a la subunidad beta de la ARN polimerasa) como una alternativa al gen 16s para clasificar 22 especies del género Leptospira y clasificarlas de acuerdo con su patogenicidad y estatus filogenético. El gen propuesto es altamente conservado y permitió aportar un blanco molecular útil para el diagnóstico e identificación del género Leptospira, que contribuye a la optimización de la vigilancia de la leptospirosis. Se utilizó un enfoque patogenómico de biología de sistemas para candidatizar e inferir factores de virulencia de la cepa colombiana relacionados con infección renal para posteriormente, evaluarlo en un modelo animal de susceptibilidad de leptospirosis. Se evaluó macroscópica e histopatológicamente el daño renal y se realizó la medición de los niveles de transcripción de factores de virulencia (Loa 22, OmpL1, LipL32). Se registraron menores signos de daño macro y microscópico a nivel de tejido renal en la cepa colombiana. En cuanto al nivel de transcripción genética de genes in vivo (Loa22, OmpL1, LipL32), se evidenció una disminución en los niveles de transcripción en la mayoría de los genes de L. santarosai serovar Alice al compararlo con los niveles de transcripción de L. interrogans serovar Copenhageni, siendo más evidente en el factor de virulencia Loa22 a 1 hora y 96 horas. Esta disminución en los niveles de transcripción general podría evidenciar por qué en el modelo hámster L. santarosai presenta menor grado de virulencia que L. interrogans serovar Copenhageni. Solo se evidenció sobrerregulación en LipL32 en bacteremia a las 96 horas e infección renal en el mismo tiempo (p < 0,05). Dichos factores de virulencia encontrados y evaluados son importantes para explicar la 7 patogenia de la bacteria a nivel renal y aporta al conocimiento de nuevos blancos diagnósticos, acción de fármacos y desarrollo de vacunas. Este trabajo contribuye con conocimientos sobre una cepa colombiana por medio del seguimiento que hace de la interacción de su genoma en la ruta infectiva en un hospedero susceptible y dilucida así algunos aspectos de como Leptospira spp causa enfermedad en una población endémica a la cual afecta directamente. Las características genómicas evidenciadas son básicas en el conocimiento de los mecanismos bacterianos, la filogenética y patogenómica de Leptospira spp. Estos conocimientos, enriquecen la información biológica del género basados en los aportes de la genómica comparativa. Palabras clave: Leptospira, patogenómica, genómica, factores de virulencia, CRISPR / Cas, bioinformática, histopatología, cuantificación relativa, infección renal.