Hisopado bucal y muda como matrices biológicas alternativas en función de estudios moleculares en serpientes
Resumen
Métodos. La toma de muestras se realizó casi en su totalidad en las instalaciones del Serpentario de la Universidad de Antioquia (SUA) programa de Ofidismo/Escorpionismo, y también fueron muestreados ejemplares que ingresaron a CBUCES-L. Por último, las fueron procesadas en el laboratorio de investigación de la Universidad CES. Los diferentes tipos de muestras fueron tomadas, rotuladas y almacenadas de manera adecuada y a la temperatura requerida por el tipo de matriz. Se recolectaron muestras tanto de ejemplares post-mortem (Sangre, músculo y escama ventral) como de ante-mortem (Muda, hisopado bucal e hisopado cloacal). Para la extracción y purificación se utilizó el kit GeneJETTM (Thermo Fisher Scientific, USA), se realizaron los pasos según el fabricante; en cuanto a las muestras de tejido, se modificó el proceso de digestión, para lo cual se utilizó el búfer propuesto por Loreille et al. (2007). Se procesaron un total de 49 muestras de las cuatro familias principales de Colombia (Boidae, Colubridae, Elapidae y Viperidae). El número de muestras vario dependiendo de la disponibilidad en SUA y CBUCES-L. La cuantificación se estimó por espectrofotometría con la herramienta nanodrop 2000 de Thermo Fisher Scientific. USA. La integridad por medio de una electroforesis en gel de agarosa al 1 %, se tiño con el colorante SYBRTM Safe (Thermo Fisher Scientific Inc., USA), se usó el búfer carga Blue/Orange Loading Dye 6X (PromegaTM), por una hora a 80 V (constante); los resultados fueron visualizados por medio de un Fotodocumentador BIO-RAD ChemiDocTM MP Imaging System, y se utilizó el marcador de peso molecular HyperLadderTM 50 bp-Bioline Thermo Fisher. Para el análisis estadístico se recurrió al programa R, por medio de la plataforma RStudio se transformaron los datos de concentración de ADN con logaritmo y se realizó una prueba T pareada para tres de las cuatro familias (Elapidae no presento suficiente número de muestras para este estudio) para comparar las matrices hisopado bucal y muda en vista de que existe un desbalance al compararlos con los datos de los individuos post-mortem. Esto se corrigió unificando las matrices de individuos post-mortem en una sola llamada referencia y por medio de una prueba de Kruskal-Wallis se determino si las matrices hisopado y muda diferían o no de las de referencia. Resultados. En general se presentaron concentraciones y purezas medias similares para todas las matrices; de acuerdo con las muestras menos invasivas para ejemplares ante-mortem en el hisopado bucal se encontró que el valor máximo para la concentración fue de 16,2 ng/μL con una pureza de 1,99; a su vez para la muda el valor máximo fue de 32,8 ng/μL con una pureza de 1,8. Por su parte para las matrices invasivas sangre presentó un valor promedio de 47,95 ng/μL con una pureza promedio de 1,85. Referente a la prueba T solo la familia Colubridae presento diferencias en la concentración y pureza al comparar las matrices menos invasivas. Respecto a la prueba de Kruskal-Wallis tanto para la concentración como la pureza no se evidenciaron diferencias entre la referencia e hisopado bucal o muda. En cuanto al patrón electroforético, solo se aprecio el 10% de las muestras de las cuales solo una presento alto peso molecular e integridad adecuada (sangre), mientras que el resto presentaron degradación y oscilaron entre 300 pb y mas de 2000 pb (pares de base).Impacto
Colecciones
- Biología [153]